Molekulární laboratoř

Přehled prováděných metod

  1. Vyšetřování vrozených trombofilních stavů
    1. Leidenská mutace genu pro FV (G1691A)
    2. Mutace genu pro protrombin FII (G20210A)
    3. Vyšetřování polymorfismu 4G/5G PAI-1
    4. Mutace genu pro MTHFR (C677T)
    5. Mutace genu pro MTHFR (A1298C)
  2. Přímá sekvenace a MLPA genů BRCA1 a BRCA2
  3. Cystická fibróza (CFTR)
  4. Celogenomové CNA (array CGH)
  5. Nesyndromická hluchota (GJB2)
  6. Porucha růstu (SHOX)
  7. Prader-Willi/Angelman syndrom (MS-PCR, UPD, MLPA) 
  8. Mikrodeleční a mikroduplikační syndromy (MLPA)
  9. Mikrodelece chromozomu Y
  10. Svalová dystrofie DMD/BMD
  11. Gilbertův syndrom
  12. Mutace genu TPMT
  13. Metabolismus warfarinu CYP2C9, VKORC
  14. Predispoziční alely k celiakii
  15. Def.apo-B100
  16. Rh-krevně skupinový systém
  17. Cytochrom P450

 Další vyšetření je možné provést na základě indikace lékařem ÚLG.

 Trombofilni stavy

Trombofilní stavy jsou vrozené nebo získané poruchy hemostázy, patofyziologicky a statisticky asociované se zvýšeným rizikem trombózy. Jejich nejvýznamnější klinickou manifestací je žilní tromboembolismus. Za vrozené trombofilní stavy je považováno několik mutací v různých genech účastnících se přímo či nepřímo koagulace nebo fibrinolýzy. Přítomnost mutovaných alel zvyšuje riziko tromboembolické nemoci (TEN), zejména v zátěžových situacích (operace, těhotenství, úrazy, dlouhé cestování, užívání hormonální antikoncepce, vážné infekce aj.).

Mezi nejčastěji vyšetřované mutace patří:

autozomálně dominantní

Leidenská mutace genu pro faktor V 1691G>A (R506Q Leiden)

mutace genu pro faktor II (prothrombin) 20210G>A

autozomálně recesivní

polymorfismus genu pro PAI-1 (-675 4G/5G)

mutace genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu (MTHFR 677C>T a 1298A>C)

Kromě TEN mohou být tyto mutace příčinou opakovaných spontánních potratů, rozštěpů neurální trubice u plodu a horšího průběhu dalších nemocí.

Leidenská mutace genu pro faktor V 1691G>A (R506Q Leiden)

Protein C je vitamin K-dependentní protein působící jako antikoagulant. Jeho účinnou formou je aktivovaný protein C (APC). Pokud v plasmě pacienta nedochází k přiměřené antikoagulační odpovědi na APC, mluvíme o APC rezistenci. Nejčastější příčinou APC rezistence je mutace koagulačního faktoru V (Leidenská mutace, FVL), kdy dojde k záměně G za A v místě 1691 (exon 10) a následně k záměně glutaminu za arginin v jednom z kritických inaktivačních míst v pozici 506 FV.1 Dochází tak k tvorbě srážlivého faktoru V, u kterého je snížena rychlost inaktivace aktivovaným proteinem C.

Přítomnost FVL je spojena se zvýšeným rizikem žilní trombózy a plicní embolie.2 Riziko žilní trombózy bývá různé dle heterozygotního nebo homozygotního stavu FVL. U heterozygotních nosičů je riziko žilní trombózy zvýšeno 7x, u homozygotních 79x.3 Ženy s trombofilními poruchami mají zvýšené riziko tromboembolické příhody při užívání hormonální antikoncepce, během gravidity a je u nich vyšší výskyt komplikací těhotenství souvisejících s poruchami průtoku krve v placentárním řečišti.

Frekvence nosičů FVL v kavkazské populaci je okolo 5 %4.

Mutace genu pro faktor II (prothrombin) 20210G>A

Mutace 20210G>A v protrombinovém genu patří mezi závažné a časté abnormality spojované s žilními trombózami a z nich vzniklými emboliemi. U více než 50 % osob s neprovokovanou trombózou nacházíme některou ze známých trombofilií. Ženy s trombofilními poruchami mají zvýšené riziko tromboembolické příhody při užívání hormonální antikoncepce, během gravidity a po porodu. Riziko stoupá ještě 3x v přítomnosti dalšího častého rizikového faktoru, kterým je FV Leiden. Dále je u těchto žen i vyšší výskyt komplikací těhotenství souvisejících s poruchami průtoku krve v placentárním řečišti a s tím spojenými spontánními aborty. Toto riziko je převážně v prvním trimestru. Mutace 20210G>A se nachází v 3’ oblasti genu, která se již nepřepisuje do proteinu, proto neexistuje specifické funkční koagulační vyšetření. Patofyziologie působení mutace není dosud úplně vysvětlena. Mutace může mít za následek buď vznik nadměrného množství mRNA, nebo jeho abnormální vlastnosti5. Incidence mutace v genu protrombinu 20210A v Kavkazské populaci se udává 2,7 % a u pacientů s TEN pak 7,1 %. Prevalence v evropské populaci se mírně liší, v severní Evropě se udává 1,7 %, v jižní Evropě pak 3 %. Přítomnost protrombinové mutace u pacientů s žilní trombózou a bez dalšího rizikového faktoru se pohybuje kolem 6 % a představuje 2,8 násobné riziko pro vznik žilní trombózy. Ve vyselektované skupině pacientů se žilní trombózou a rodinnou historií žilní trombózy byla nalezena u 18 %6.

Mutace genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu (MTHFR 677C>T a 1298A>C)

Enzym 5,10-methylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR) katalyzuje konverzi 5,10-methylentetrahydrofolátu na 5-methyl-tetrahydrofolát, který je hlavní formou folátu v lidském organismu. Foláty se účastní mj. methylace homocysteinu a syntézy nukleotidů, neurotransmiterů proteinů a fosfolipidů.

Bylo popsáno několik polymorfismů a mutací v MTHFR genu snižujících aktivitu enzymu MTHFR.

Substituce nukleotidu C za nukleotid T v pozici 677 nukleotidového řetězce má za následek záměnu alaninového zbytku za valinový v pozici 222 aminokyselinového řetězce (ala222val)1.

Substituce nukleotidu A za nukleotid C v pozici 1298 nukleotidového řetězce má za následek záměnu glutaminového zbytku za alaninový v pozici 429 aminokyselinového řetězce (Glu429Ala)1. Důsledkem mutací dojde k modifikaci molekuly enzymu a vzniku její termolabilní varianty se sníženou aktivitou. Nízká aktivita enzymu má pak za následek defekt remethylace s následnou vyšší hladinou aminokyseliny homocysteinu v séru. Dědičný defekt MTHFR vede nejčastěji k mírné formě onemocnění a porucha se projeví zejména při současném nedostatku kyseliny listové2.

Vysoká hladina homocysteinu je rovněž rizikovým faktorem vzniku defektu neurální trubice během prenatálního vývoje3.

Polymorfismus genu pro PAI-1 (-675 4G/5G)

Aktivátor inhibitoru plazminogenu (PAI-1) je primární inhibitor fibrinolýzy. Gen kódující tento protein je lokalizován na sedmém chromozomu (77q21.3.-q22) a kóduje proteino velikosti 402 aminokyselin.jsou Byly v něm popsané dvě mutace (ins4997TA a –675 4G/5G). Obě mutace se projevují jako autozomálně recesivně dědičné onemocnění. Námi vyšetřovaný polymorfismus 4G/5G má vliv na průběh infekčních chorob, trombózy, Crohnovu nemoc, infarkt myokardu, mortalitu při sepsi, preeklamsii aj.1 Alela 4G je spojována s vyšší expresí genu a vyšší koncentrací PAI-1 v plazmě (úměrně počtu 4G alel). Frekvence jednotlivých genotypů se udávají: 32% 4G/4G, 49% 4G/5G, 19% 5G/5G.

Dále byla u inhibitoru aktivátoru plasminogenu byla statisticky prokázána silná korelace mezi genotypem PAI1 4G/4G a těhotenskými ztrátami. Porucha regulace exprese PAI1 na podkladě mutace promotorové oblasti genu vede podle současných teorií k poruše fibrinolýzy a zásadním způsobem se proto odlišuje od ostatních sledovaných (prokoagulačních) mutací zejména vzhledem k nutnosti hledání odlišných cest terapeutického ovlivnění jejích projevů. U inhibitoru aktivátoru plasminogenu byla statisticky prokázána silná korelace mezi genotypem PAI1 4G/4G a těhotenskými ztrátami. 2,3

Cystická fibróza

Cystická fibróza patří v naší republice mezi nejčastější autozomálně recesivně dědičné onemocnění. Incidence se odhaduje na 1/2700 – 1/3800 novorozenců a frekvence zdravých přenašečů pak na 1/26 – 1/33.(1) Onemocnění je způsobené mutací genu produkujícího protein CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) a má velice závažnou prognózou. Poruchy CFTR proteinu zahrnují celé spektrum onemocnění počínaje kongenitální agenezí vas deferens, dále manifestace v oblasti gastrointestinálního traktu či exokrinními poruchami a konče klasickou formou cystické fibrózy s multiorgánovým postižením včetně postižení plic, které je hlavní příčinou morbidity a mortality.(2) Včasná diagnostika do dvou měsíců života významně ovlivňuje průběh a prognózu tohoto onemocnění. Z celkového počtu 30 doposud u nás nalezených mutací (zahrnujících celkem 95 % všech CF alel) se pouze 8 mutací vyskytuje na více než 1 % CF patologických alel.(1) Cílem genetického poradenství u CF je poskytnout rodičům co nejvíce informací o nejen o klinických projevech a prognóze tohoto onemocnění, ale i o principu dědičnosti a nabídnout rodině možnost genetické vyšetření. V rámci prekoncepční péče informujeme páry o možnostech prenatální diagnostiky tohoto onemocnění. Smyslem je umožnit rodině narození dítěte nepostiženého CF. Tak jako pro jiná autozomálně recesivní onemocnění, platí i pro cystickou fibrózu fakt, že spektrum mutací je u různých etnických skupin rozdílné a je proto důležité znát i etnický a geografický původ pacienta z důvodu provedení vhodného vyšetření, ale i správné interpretace výsledku vyšetření. (3)

Mikrodelece

Genetické faktory hrají důležitou roli v etiopatogenezi mužské infertility. Důležitou úlohu mají geny lokalizované na Y chromozomu. Kromě SRY genu (sex-determining region Y = testes určujícím faktor) jsou pro spermatogenezi důležité také azoospermické faktory. Tzv. AZF lokus (azoospermia factor locus) se nachází na dlouhém raménku Y chromosomu. Delece v tomto úseku se vyskytují v souvislosti s azoospermií a těžkou oligospermií.[1] Celkem jsou známy 3 azoospermické oblasti označeny jako AZFa, AZFb a AZFc (viz obrázek). Mikrodelece byly nalezeny asi u 7,3% infertilních mužů, z čehož nejčastější je delece regionu AZFc. Velká většina delecí byla nalezena u azoospermatických mužů (66%), méně u mužů s koncentrací spermií pod 5x106/ml (28%) a sporadicky u mužů s koncentrací spermií nad 5x106/ml (6%).[2,3] V případě IVF gametami nemocného hrozí přenesení poruchy na potomka mužského pohlaví.

Aneuploidie chromosomů 13, 18, 21, X a Y

Aneuploidie jsou nejčastějším typem chromosomálních poruch, které se vyskytují nejméně u 3 – 4 % všech klinicky rozpoznatelných těhotenství. Většina aneuploidních pacientů má buď trisomii nebo méně často monosomii některého chromosomu. Jak trisomie, tak monosomie mají těžké fenotypické následky.1

Trisomie celého chromosomu jsou ve většině případů letální. Trisomie chromosomů 21, 18 a 13 jsou jediné autosomální trisomie, které jsou po narození slučitelné se životem a pouze jedinci s trisomií 21 přežívají déle než 1 rok.2

Monosomie celého chromosomu je téměř vždy letální, výjimkou je monosomie chromosomu X. Aneuploidie pohlavních chromosomů (gonosomů) jsou spojené s mírnějšími fenotypovými projevy než aneuploidie autosomů. Zahrnují početní nebo strukturální změny pohlavních chromosomů X/Y, popsané několika syndromy.

Aneuploidie mohou zahrnovat celý chromosom nebo jen jeho část (částečná monosomie/trisomie). Rovněž může být přítomna pouze v některých buňkách (mozaikové formy). Fenotyp zpravidla odpovídá rozsahu chromosomálních změn.

Mutace genu TPMT

TPMT je enzym cytosolu a je klíčovým enzymem biodegradace thiopurinů. Katalyzuje S-metylaci aromatických a heterocyklických sulfhydrylových komponent thiopurinových léčiv (6-merkaptopurinu, azathioprinu, 6-thioguaninu).

Thiopurinová léčiva jsou analoga purinových basí, které po inkorporaci do nukleových kyselin brání proliferaci rychle se dělících buněk. Takto je postižena především činnost T lymfocytů. Jsou používána jako imunosupresiva především u idiopatických střevních zánětů, transplantací, ale i jako protinádorová terapie u hematoonkologických onemocnění.

Defekt v TPMT genu vede ke snížení methylace a snížení inaktivace 6-merkaptopurinu vedoucímu k zesílení toxicity především ke kostní dřeni, která může vést k myelosupresi (anemie, tendence ke krvácení, leukopenie). Dalšími nežádoucími účinky může být hepatotoxicita, zvýšený výskyt infekčních onemocnění, cholestatický ikterus nebo kožní alergické reakce.

Gen pro TPMT je lokalizován na krátkém raménku chromosomu 6 (6p22.3), má 10 exonů a jeho velikost je 34 kb. Nejčastější alelické varianty jsou: 1* (bez mutace), 2* (mutace G238C), 3A* (mutace G460A společně s A719G), 3B* (mutace G460A) a 3C* (mutace A719G). Obecně pacienti bez mutace jsou rychlí metabolizátoři, s jednou mutovanou alelou středně rychlí metabolizátoři a u pacientů s oběma mutovanýma alelama je potřeba dávku thiopurinového léčiva snížit až o 90 %.

Vyšetření nejčastějších alelických variant výrazně snížuje riziko závažného nežádoucího účinku, který může být u disponovaných jedinců i smrtelný. Výsledek testu je zároveň vhodným vodítkem k určení adekvátní dávky léčiva.

Gilbertova choroba

Gilbertova choroba patřící mezi funkční „benigní“ familiární hyperbilirubinémie. Je charakterizována mírným chronickým zvýšením hladiny nepřímého (nekonjugovaného) bilirubinu v séru bez známek hemolýzy a dalších známek jaterního postižení. Je to dědičná AR porucha metabolismu žlučového barviva bilirubinu v krvi.1 Frekvence mutací je u obou pohlaví stejná (v ČR asi 5%) a výskyt onemocnění (projevů) je vyšší u mužů než u žen (poměr 4:1), což je nejspíše dáno vlivem testosteronu na snížení aktivity enzymu UDP-glucuronosyltransferasa.3 Tento enzym je kódovaný genem UGT 1A1 umístěným v oblasti 2q37. Gen UGT 1A1 má 5 exonů a délku 218 kb. Z genetického hlediska je onemocnění způsobeno inzercí skupiny dinukleotidů (TA) do promotorové oblasti UGT 1A1 genu, kdy zdravá alela obsahuje 6 TA sekvencí, avšak u mutované alely se po inzerci zvýší počet TA sekvencí na 7. Jsou popisovány i polymorfismy A(TA)5TAAa A(TA)8TAA a další bodové mutace přímo v exonech genu UGT1A1 (např.Gly71Arg). Pacienti s Gilbertovou chorobou mají sníženou aktivitou enzymu UDP-glukuronosyltransferasa na 20-30% aktivity oproti normálu.1,2 V důsledku toho je v krevní plazmě přebytek nekonjugovaného bilirubinu, který je pomaleji konjugován s kyselinou glukuronovou než u zdravých jedinců.