Základní informace o vyšetřeních

Od roku 2017 jsou na základě požadavku zdravotních pojišťoven regulovány indikace a vykazování některých vyšetřovacích metod hrazených z prostředků zdravotního pojištění v odbornosti Laboratoř lékařské genetiky

Tato regulace se dotýká i činnosti Genetické laboratoře Ústavu lékařské genetiky FN Plzeň.

Vždy aktuální infomace o této problematice je možné získat na stránkách Všeobecné zdravotní pojišťovny ČR zde

Cytogenetická vyšetření

Vyšetření konstitučního karyotypu

Z buněk jednotlivých tkání (periferní krev (PK), včetně fetální krve (FK), plodová voda (PV), choriové klky a jiné produkty koncepce, např. potracené plody (FT)) se provádí pro stanovení konstituční chromosomové výbavy jedince, resp. plodu a jejích odchylek.

Vyšetření karyotypu z periferní a fetální krve je provedeno na T-lymfocytech periferní, resp. fetální krve po krátkodobé kultivaci buněk krve se selektivní stimulací buněčného dělení T-lymfocytů lektinem PHA a synchronizací buněčného dělení.

Vyšetření karyotypu z plodové vody a choriových klků nebo jiných produktů koncepce je provedeno na buňkách plodové vody (amniocytech), choriových klků nebo jiných produktů koncepce po dlouhodobé kultivaci v růstovém kultivačním médiu.

Zjištění patologického cytogenetického nálezu v buňkách plodové vody nebo produktů koncepce z probíhajícího těhotenství může být indikací k ukončení těhotenství do konce 24. týdne těhotenství z genetických důvodů.

Hodnocení karyotypu je prováděno mikroskopicky s následnou počítačovou obrazovou analýzou. Další informace viz literatura (Hájek 2000, Michalová 1999, Rooney 1992).

Vyšetření karyotypu z nádorových buněk

Provádí se pro stanovení získaných klonálních aberací v souvislosti se vznikem nádorového onemocnění. V Genetické laboratoři ÚLG se vyšetření nádorového karyotypu provádí z buněk kostní dřeně či periferní krve v souvislosti z hemotologickými neopláziemi. Toto vyšetření má dle různých typů hemato-onkologického onemocnění význam diagnostický a/nebo prognostický.

Chromosomová analýza je provedena na buňkách kostní dřeně nebo periferní krve po krátkodobé cytogenetické kultivaci (24-72 hod.). Základní kultivace využívá spontánního dělení neoplastických buněk in vitro, u některých typů hematologických neoplázií je vhodná stimulace buněčného dělení (CLL, ALL apod.).

Hodnocení karyotypu je prováděno mikroskopicky s následnou počítačovou obrazovou analýzou. Další informace viz Michalová K.: Úvod do lidské cytogenetiky a Rooney D. E., Czepulkowski B. H.: Human Cytogenetics. A Practical Approach.

Vyšetření fluorescenční in situ hybridizací (FISH)

Je molekulárně cytogenetická metoda prováděná zejména pro stanovení submikroskopických chromosomových aberací (delece, duplikace, kryptické translokace) a/nebo pro ověření a doplnění nálezu při vyšetření karyotypu. Mohou být vyšetřeny metafázní a/nebo interfázní jádra. V případě vyšetření nádorových buněk je zároveň i vhodnou metodou pro sledování úspěšnosti léčby.

Vyšetření je možné provádět na cytogenetických preparátech připravených pro analýzu karyotypu nebo stěru buněk bukální sliznice a obdobných preparátech.

Metoda FISH je založena na komplementárním párování vyšetřovaného chromosomového lokusu a fluorescenčně značené DNA sondy. Sondy mohou být lokusově specifické (LSI) pro oblast jedinečné sekvence (např. genové sondy nebo sondy do subtelomerických oblastí), celochromosomové (tzv. wcp, pokrývají celý chromosom) nebo centromerické (tzv. CEP).

Hybridizace DNA ve vyšetřovaném lokusu a sondy probíhá po předchozí denaturaci teplem a/nebo působením organických roztoků přímo na mikroskopických sklech vyšetřovaného vzorku („in situ“). Po skončení hybridizace je přebytečná nenavázaná sonda odmyta (v reakci je vždy nadbytek sondy). Vhodně podbarvená jádra a počet či pozici fluorescenčně značených sond (signálů) hodnotíme pozorováním ve fluorescenčním mikroskopu s následnou počítačovou obrazovou analýzou.

Další informace viz Michalová K.: Úvod do lidské cytogenetiky a Rooney D. E., Czepulkowski B. H.: Human Cytogenetics. A Practical Approach

Molekulárně genetická vyšetření

Trombofilni stavy

Trombofilní stavy jsou vrozené nebo získané poruchy hemostázy, patofyziologicky a statisticky asociované se zvýšeným rizikem trombózy. Jejich nejvýznamnější klinickou manifestací je žilní tromboembolismus. Za vrozené trombofilní stavy je považováno několik mutací v různých genech účastnících se přímo či nepřímo koagulace nebo fibrinolýzy. Přítomnost mutovaných alel zvyšuje riziko tromboembolické nemoci (TEN), zejména v zátěžových situacích (operace, těhotenství, úrazy, dlouhé cestování, užívání hormonální antikoncepce, vážné infekce aj.).

Mezi nejčastěji vyšetřované mutace patří:

Autozomálně dominantní

  • Leidenská mutace (FaktorV 1691G>A (R506Q Leiden)
  • Mutace v protrombinovém genu (FaktorII 20210G>A)

Autozomálně recesivní

  • Mutace genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu (MTHFR 677C>T a 1298A>C)
  • Polymorfismus genu PAI-1 (-675 4G/5G)

Kromě TEN mohou být tyto mutace příčinou opakovaných spontánních potratů, rozštěpů neurální trubice u plodu a horšího průběhu dalších nemocí.

  • Leidenská mutace (FaktorV 1691G>A (R506Q Leiden)

Protein C je vitamin K-dependentní protein působící jako antikoagulant. Jeho účinnou formou je aktivovaný protein C (APC). Pokud v plasmě pacienta nedochází k přiměřené antikoagulační odpovědi na APC, mluvíme o APC rezistenci. Nejčastější příčinou APC rezistence je mutace koagulačního faktoru V (Leidenská mutace, FVL), kdy dojde k záměně G za A v místě 1691 (exon 10) a následně k záměně glutaminu za arginin v jednom z kritických inaktivačních míst v pozici 506 FV. Dochází tak k tvorbě srážlivého faktoru V, u kterého je snížena rychlost inaktivace aktivovaným proteinem C.

Přítomnost FVL je spojena se zvýšeným rizikem žilní trombózy a plicní embolie. Riziko žilní trombózy bývá různé dle heterozygotního nebo homozygotního stavu FVL. U heterozygotních nosičů je riziko žilní trombózy zvýšeno 7x, u homozygotních 79x. Ženy s trombofilními poruchami mají zvýšené riziko tromboembolické příhody při užívání hormonální antikoncepce, během gravidity a je u nich vyšší výskyt komplikací těhotenství souvisejících s poruchami průtoku krve v placentárním řečišti.

Frekvence nosičů FVL v kavkazské populaci je okolo 5 %.

  • Mutace v protrombinovém genu (Faktor II 20210G>A)

Mutace 20210G>A v protrombinovém genu patří mezi závažné a časté abnormality spojované s žilními trombózami a z nich vzniklými emboliemi. U více než 50 % osob s neprovokovanou trombózou nacházíme některou ze známých trombofilií. Ženy s trombofilními poruchami mají zvýšené riziko tromboembolické příhody při užívání hormonální antikoncepce, během gravidity a po porodu. Riziko stoupá ještě 3x v přítomnosti dalšího častého rizikového faktoru, kterým je FV Leiden. Dále je u těchto žen i vyšší výskyt komplikací těhotenství souvisejících s poruchami průtoku krve v placentárním řečišti a s tím spojenými spontánními aborty. Toto riziko je převážně v prvním trimestru. Mutace 20210G>A se nachází v 3’ oblasti genu, která se již nepřepisuje do proteinu, proto neexistuje specifické funkční koagulační vyšetření. Patofyziologie působení mutace není dosud úplně vysvětlena. Mutace může mít za následek buď vznik nadměrného množství mRNA, nebo jeho abnormální vlastnosti5. Incidence mutace v genu protrombinu 20210A v Kavkazské populaci se udává 2,7 % a u pacientů s TEN pak 7,1 %. Prevalence v evropské populaci se mírně liší, v severní Evropě se udává 1,7 %, v jižní Evropě pak 3 %. Přítomnost protrombinové mutace u pacientů s žilní trombózou a bez dalšího rizikového faktoru se pohybuje kolem 6 % a představuje 2,8 násobné riziko pro vznik žilní trombózy. Ve vyselektované skupině pacientů se žilní trombózou a rodinnou historií žilní trombózy byla nalezena u 18 %.

  • Mutace genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu (MTHFR 677C>T a 1298A>C)

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Enzym 5,10-methylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR) katalyzuje konverzi 5,10-methylentetrahydrofolátu na 5-methyl-tetrahydrofolát, který je hlavní formou folátu v lidském organismu. Foláty se účastní mj. methylace homocysteinu a syntézy nukleotidů, neurotransmiterů proteinů a fosfolipidů.

Bylo popsáno několik polymorfismů a mutací v MTHFR genu snižujících aktivitu enzymu MTHFR.

Substituce nukleotidu C za nukleotid T v pozici 677 nukleotidového řetězce má za následek záměnu alaninového zbytku za valinový v pozici 222 aminokyselinového řetězce (ala222val).

Substituce nukleotidu A za nukleotid C v pozici 1298 nukleotidového řetězce má za následek záměnu glutaminového zbytku za alaninový v pozici 429 aminokyselinového řetězce (Glu429Ala). Důsledkem mutací dojde k modifikaci molekuly enzymu a vzniku její termolabilní varianty se sníženou aktivitou. Nízká aktivita enzymu má pak za následek defekt remethylace s následnou vyšší hladinou aminokyseliny homocysteinu v séru. Dědičný defekt MTHFR vede nejčastěji k mírné formě onemocnění a porucha se projeví zejména při současném nedostatku kyseliny listové.

Vysoká hladina homocysteinu je rovněž rizikovým faktorem vzniku defektu neurální trubice během prenatálního vývoje.

  • Polymorfismus genu PAI-1 (-675 4G/5G)

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Aktivátor inhibitoru plazminogenu (PAI-1) je primární inhibitor fibrinolýzy. Gen kódující tento protein je lokalizován na sedmém chromozomu (77q21.3.-q22) a kóduje proteino velikosti 402 aminokyselin.jsou Byly v něm popsané dvě mutace (ins4997TA a –675 4G/5G). Obě mutace se projevují jako autozomálně recesivně dědičné onemocnění. Námi vyšetřovaný polymorfismus 4G/5G má vliv na průběh infekčních chorob, trombózy, Crohnovu nemoc, infarkt myokardu, mortalitu při sepsi, preeklampsii aj. Alela 4G je spojována s vyšší expresí genu a vyšší koncentrací PAI-1 v plazmě (úměrně počtu 4G alel). Frekvence jednotlivých genotypů se udávají: 32% 4G/4G, 49% 4G/5G, 19% 5G/5G.

Dále byla u inhibitoru aktivátoru plasminogenu byla statisticky prokázána silná korelace mezi genotypem PAI1 4G/4G a těhotenskými ztrátami. Porucha regulace exprese PAI1 na podkladě mutace promotorové oblasti genu vede podle současných teorií k poruše fibrinolýzy a zásadním způsobem se proto odlišuje od ostatních sledovaných (prokoagulačních) mutací zejména vzhledem k nutnosti hledání odlišných cest terapeutického ovlivnění jejích projevů. U inhibitoru aktivátoru plasminogenu byla statisticky prokázána silná korelace mezi genotypem PAI1 4G/4G a těhotenskými ztrátami.

  • Cystická fibróza

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Cystická fibróza patří v naší republice mezi nejčastější autozomálně recesivně dědičné onemocnění. Incidence se odhaduje na 1/2700 – 1/3800 novorozenců a frekvence zdravých přenašečů pak na 1/26 – 1/33. Onemocnění je způsobené mutací genu produkujícího protein CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) a má velice závažnou prognózou. Poruchy CFTR proteinu zahrnují celé spektrum onemocnění počínaje kongenitální agenezí vas deferens, dále manifestace v oblasti gastrointestinálního traktu či exokrinními poruchami a konče klasickou formou cystické fibrózy s multiorgánovým postižením včetně postižení plic, které je hlavní příčinou morbidity a mortality.(2) Včasná diagnostika do dvou měsíců života významně ovlivňuje průběh a prognózu tohoto onemocnění. Z celkového počtu 30 doposud u nás nalezených mutací (zahrnujících celkem 95 % všech CF alel) se pouze 8 mutací vyskytuje na více než 1 % CF patologických alel.Cílem genetického poradenství u CF je poskytnout rodičům co nejvíce informací o nejen o klinických projevech a prognóze tohoto onemocnění, ale i o principu dědičnosti a nabídnout rodině možnost genetické vyšetření. V rámci prekoncepční péče informujeme páry o možnostech prenatální diagnostiky tohoto onemocnění. Smyslem je umožnit rodině narození dítěte nepostiženého CF. Tak jako pro jiná autozomálně recesivní onemocnění, platí i pro cystickou fibrózu fakt, že spektrum mutací je u různých etnických skupin rozdílné a je proto důležité znát i etnický a geografický původ pacienta z důvodu provedení vhodného vyšetření, ale i správné interpretace výsledku vyšetření.

  • Mikrodelece chromosomu Y

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Genetické faktory hrají důležitou roli v etiopatogenezi mužské infertility. Důležitou úlohu mají geny lokalizované na Y chromozomu. Kromě SRY genu (sex-determining region Y = testes určujícím faktor) jsou pro spermatogenezi důležité také azoospermické faktory. Tzv. AZF lokus (azoospermia factor locus) se nachází na dlouhém raménku Y chromosomu. Delece v tomto úseku se vyskytují v souvislosti s azoospermií a těžkou oligospermií.[1] Celkem jsou známy 3 azoospermické oblasti označeny jako AZFa, AZFb a AZFc (viz obrázek). Mikrodelece byly nalezeny asi u 7,3% infertilních mužů, z čehož nejčastější je delece regionu AZFc. Velká většina delecí byla nalezena u azoospermatických mužů (66%), méně u mužů s koncentrací spermií pod 5x106/ml (28%) a sporadicky u mužů s koncentrací spermií nad 5x106/ml (6%).[2,3] V případě IVF gametami nemocného hrozí přenesení poruchy na potomka mužského pohlaví.

  • Aneuploidie chromosomů 13, 18, 21, X a Y

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Aneuploidie jsou nejčastějším typem chromosomálních poruch, které se vyskytují nejméně u 3 – 4 % všech klinicky rozpoznatelných těhotenství. Většina aneuploidních pacientů má buď trisomii nebo méně často monosomii některého chromosomu. Jak trisomie, tak monosomie mají těžké fenotypické následky.1

Trisomie celého chromosomu jsou ve většině případů letální. Trisomie chromosomů 21, 18 a 13 jsou jediné autosomální trisomie, které jsou po narození slučitelné se životem a pouze jedinci s trisomií 21 přežívají déle než 1 rok.

Monosomie celého chromosomu je téměř vždy letální, výjimkou je monosomie chromosomu X. Aneuploidie pohlavních chromosomů (gonosomů) jsou spojené s mírnějšími fenotypovými projevy než aneuploidie autosomů. Zahrnují početní nebo strukturální změny pohlavních chromosomů X/Y, popsané několika syndromy.

Aneuploidie mohou zahrnovat celý chromosom nebo jen jeho část (částečná monosomie/trisomie). Rovněž může být přítomna pouze v některých buňkách (mozaikové formy). Fenotyp zpravidla odpovídá rozsahu chromosomálních změn.

  • Mutace genu TPMT

TPMT je enzym cytosolu a je klíčovým enzymem biodegradace thiopurinů. Katalyzuje S-metylaci aromatických a heterocyklických sulfhydrylových komponent thiopurinových léčiv (6-merkaptopurinu, azathioprinu, 6-thioguaninu).

Thiopurinová léčiva jsou analoga purinových basí, které po inkorporaci do nukleových kyselin brání proliferaci rychle se dělících buněk. Takto je postižena především činnost T lymfocytů. Jsou používána jako imunosupresiva především u idiopatických střevních zánětů, transplantací, ale i jako protinádorová terapie u hematoonkologických onemocnění.

Defekt v TPMT genu vede ke snížení methylace a snížení inaktivace 6-merkaptopurinu vedoucímu k zesílení toxicity především ke kostní dřeni, která může vést k myelosupresi (anemie, tendence ke krvácení, leukopenie). Dalšími nežádoucími účinky může být hepatotoxicita, zvýšený výskyt infekčních onemocnění, cholestatický ikterus nebo kožní alergické reakce.

Gen pro TPMT je lokalizován na krátkém raménku chromosomu 6 (6p22.3), má 10 exonů a jeho velikost je 34 kb. Nejčastější alelické varianty jsou: 1* (bez mutace), 2* (mutace G238C), 3A* (mutace G460A společně s A719G), 3B* (mutace G460A) a 3C* (mutace A719G). Obecně pacienti bez mutace jsou rychlí metabolizátoři, s jednou mutovanou alelou středně rychlí metabolizátoři a u pacientů s oběma mutovanýma alelama je potřeba dávku thiopurinového léčiva snížit až o 90 %.

Vyšetření nejčastějších alelických variant výrazně snížuje riziko závažného nežádoucího účinku, který může být u disponovaných jedinců i smrtelný. Výsledek testu je zároveň vhodným vodítkem k určení adekvátní dávky léčiva.

  • TNF-A

Tumor necrosis faktor alfa patří mezi cytokiny a je považován za jeden z nejvýznamnějších prozánětlivých mediátorů. Zvyšuje produkci dalších cytokinů, PAI-1 a adhezivních molekul. TNF-α uvolňují makrofágy, monocyty, endoteliární buňky, neutrofily, buňky hladké svaloviny, aktivované lymfocyty a astrocyty. Uvolněný TNF-α je zodpovědný za vznik tzv. lokální imunitní odpověďi, při které se aktivuje endotel vlásečnic, zvyšuje prostupnost cévního řečiště a zvyšuje se srážení krve v místě zánětu. Zvýšená produkce TNF-α je dávána do souvislosti se střevními záněty (ISZ), rozvojem demence u HIV+ pacientů, astmatem, psoriázou, lupus erythematosus a septickým šokem.

  • Gilbertova choroba

Gilbertova choroba patřící mezi funkční „benigní“ familiární hyperbilirubinémie. Je charakterizována mírným chronickým zvýšením hladiny nepřímého (nekonjugovaného) bilirubinu v séru bez známek hemolýzy a dalších známek jaterního postižení. Je to dědičná AR porucha metabolismu žlučového barviva bilirubinu v krvi.1 Frekvence mutací je u obou pohlaví stejná (v ČR asi 5%) a výskyt onemocnění (projevů) je vyšší u mužů než u žen (poměr 4:1), což je nejspíše dáno vlivem testosteronu na snížení aktivity enzymu UDP-glucuronosyltransferasa.3 Tento enzym je kódovaný genem UGT 1A1 umístěným v oblasti 2q37. Gen UGT 1A1 má 5 exonů a délku 218 kb. Z genetického hlediska je onemocnění způsobeno inzercí skupiny dinukleotidů (TA) do promotorové oblasti UGT 1A1 genu, kdy zdravá alela obsahuje 6 TA sekvencí, avšak u mutované alely se po inzerci zvýší počet TA sekvencí na 7. Jsou popisovány i polymorfismy A(TA)5TAAa A(TA)8TAA a další bodové mutace přímo v exonech genu UGT1A1 (např.Gly71Arg). Pacienti s Gilbertovou chorobou mají sníženou aktivitou enzymu UDP-glukuronosyltransferasa na 20-30% aktivity oproti normálu.1,2 V důsledku toho je v krevní plazmě přebytek nekonjugovaného bilirubinu, který je pomaleji konjugován s kyselinou glukuronovou než u zdravých jedinců.

  • Hereditární hemochromatóza

Hemochromatóza (také hereditární či genetická hemochromatóza, zkr. HH či GH) je jedno z nejčastějších monogenních onemocnění s autosomálně recesivním typem dědičnosti. Pro hemochromatózu je typickýnástup projevů onemocnění v dospělém věku (přibližně ve 40 letech a později). Incidence tohoto onemocnění  v západní, severní a střední Evropě se udává 1/300 – 1/400, incidence přenašečů asi 1/10.

Podstatou hemochromatózy je nadměrné střádání železa. Železo je nejprve nadměrně resorbováno v duodenu, později se nadbytečné železo ukládá nejdříve do hepatocytů a následně do žlučovodů, Kupfferových buněk a makrofágů. Hlavní a nejzávažnější manifestací onemocnění je rozvoj jaterní cirhózy s možným vznikem hepatocelulárního karcinomu. Dále může být postižen i myokard, pankreas, klouby a varlata.

Hemochromatóza typu 1 (HFE1) je spojována s patogenními variantami v genu HFE, který je lokalizován na 6. chromosomu. Vyšetřují se obvykle tři nejčastější patogenní varianty:C282Y, H63D a S65C. Patogenní varianty C282Y a H63D se nacházejí u více než 80 % pacientů, nejméně častá patogenní varianta S65C pak asi u 8% pacientů s hereditární hemochromatózou. (S65C and Other Mutations in the Haemochromatosis Gene in the Czech Population, M. Cimburova et all, Folia Biologica (Praha) 51, 172-176 (2005); Doporučený postup ČHS pro diagnostiku a léčbu genetické (hereditární) hemochromatózy, zpracoval Prof. MUDr. J. Horák)

  • Nesyndromová neurosenzorová autosomálně recesivní hluchota na podkladě variant genu GJB2

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Více než 50 % vrozených poruch sluchu má genetickou příčinu, nesyndromové poruchy sluchu jsou v 75 – 80 % autosomálně recesivní, ve 20 - 25% autosomálně dominantní a v 1-2 % X- vázané. Přibližně 50 % autosomálně recesivních nesyndromových ztrát sluchu je důsledek formy nesyndromové neurosenzorové autosomálně recesivní hluchoty (DFNB1), způsobené patogenními variantami v genu GJB2 (kódujícím protein connexin 26) a genu GJB6 (kódujícím protein connexin 30). GJB geny (gap junction genes) jsou lokalizovány na chromozomu 13 a kódují proteiny connexiny. Tyto proteiny jsou důležitou součástí transmembránových kanálů vnitřního ucha zajišťující transport draslíkových iontů.

V naší laboratoři vyšetřujeme kódující oblasti a intronové varianty IVS1+1G>A genu GJB2 metodou přímé sekvenace. Provedeným vyšetřením lze zachytit více než 99 % známých mutací genu GJB2.

  • Hereditární nádorové syndromy - NGS panel

Vyšetření může indikovat pouze klinický genetik.

Dědičné (hereditární) nádorové syndromy tvoří asi 5 – 10 % všech nádorů. Vyšetření je prováděno pomocí sekvenace nové generace ( NGS). V panelu je zahrnuto 226 genů, pro rutinní vyšetření hodnotíme 22 klíčových genů velkého (RR > 5) a středního (RR 2 - 5) rizika pro nejčastější hereditární nádorové syndromy: syndrom dědičného karcinomu prsu a vaječníků (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, NBN, PALB2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, STK11, TP53), Lynchův syndrom (EPCAM, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) a střevní polypózy (APC, BMPR1A, MUTYH, SMAD4).

Vzhledem k rozsahu použitého hybridizačního panelu nelze vyloučit incidentální záchyt sekvenčních variant v dalších genech.

Aktualizováno 28. 5. 2020